Tiedot

Pyura DNA:n uuttaminen

Pyura DNA:n uuttaminen


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kamppailen genomisen DNA:n erottamisen kanssa eri Pyura chilensis -näytteistä; DNA hajoaa, kuten geelistä voidaan nähdä.

Olemme aina käyttäneet GeneJET Genomic DNA -puhdistussarjaa (ThermoFisher), ja se toimii hyvin näytteille muista lajeista; joten sarja ei ole ongelma.

Olemme aina käyttäneet 95-prosenttisessa etanolissa varastoituja kudosnäytteitä (jotka pestään vedellä ennen DNA:n uuttamista), mutta ongelma jatkuu riippumatta siitä, ovatko näytteet yhden päivän vai muutaman vuoden vanhoja. Säilytysmenetelmä näyttää toimivan hyvin gDNA:n erottamiseen muista lajeista.

Sitten veikkaan, että ongelma on itse Pyurassa. Joten minun on selvitettävä, onko joko purku tai tallennus sopiva Pyuralle. Luin, että Pyurassa on paljon kuparia. Suunnittelimme käyttämään uutta puskuria sen varastointiin: suolaa Saturated DMSO, joka sisältää EDTA:ta.

Haluaisin kysyä, onko kukaan teistä koskaan työskennellyt tämän organismin kanssa (ja jos olette, niin kuinka onnistuitte erottamaan siitä DNA:ta). Onko sinulla ehdotuksia DNA-puhdistusmenetelmistä?

1. kaista on tikkaat (1kb) ja viimeiset 3 kaistaa, joissa on pitkiä hämärtyneitä juttuja juovien sijaan, ovat DNA-näytteitäni.


Geelikuvaasi viitaten genomi-DNA (kolmessa Pyuran näytekaistassa) ei näytä pahasti hajonneelta. Jos kokomerkki on 1 kb tikapuut, niin suurin osa DNA:sta on molekyylikooltaan suuri. Uuton aikana on yleistä, että suurimolekyylipainoinen DNA "leikkautuu" jossain määrin (hajoaa mekaanisesti pienemmiksi fragmenteiksi). Tämä voi näkyä muodossa heikko alaspäin tahraa. Myös kaistat voivat olla hieman ylikuormitettuja. Voit yrittää käyttää hellävaraisempaa poistotekniikkaa ja katsoa, ​​auttaako se tyytyväisyyttäsi. Mikä tahansa mainitsemistasi toimii.

Huonosti hajonnut genominen DNA näyttäytyisi voimakkaampana "smearna" lähellä 1 kb:n kokostandardin alaosaa.


Tämä on julkaistu Segovian et al. 2017:

Jokaisen yksilön vaippakudosta (0,2 g) käytettiin DNA:n uuttamiseen käyttämällä DNeasy Blood® & Tissue Kit -sarjaa (QIAGEN®, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA:n määrä/puhtaus mitattiin Nanodrop 2 000:ssa (Thermo, USA).

He ovat tehneet SNP-tunnistuksen genomista. Joten oletan, että heidän gDNA:nsa olisi ollut kunnollinen laatu.


Pyura DNA:n erottaminen - Biologia

Systematic Zoology Lab Practicumin raportti, elokuu 2010

Sytokromi c Oksidaasialayksikön I osittainen sekvenssi oletetusta kalanoidihaarajalkaisesta, joka on saatu Pyura vittata (Chordata: Ascidiacea: Pleurogona: Pyuridae)

Division of Biology, Department of Biological Sciences, School of Science, Hokkaido University, Sapporo 060-0810, Japani

Materiaali ja metodit
Shin Hayase sai 31. toukokuuta 2010 Oshoron lahdella Hokkaidossa, Japanissa, noin 43°12&primeN, 140°51&primeE, askidiaanin, jonka valokuvasi ja tunnisti Hiroshi Kajihara. Pyura vittata perustui Nishikawaan (1992: 600, s. 144-1) ennen kiinnitystä 99 % EtOH:ssa. DNA uutettiin näytteen ruoansulatuskanavasta silikamenetelmällä (Boom et ai. 1990) pienin muutoksin. Uutettu DNA liuotettiin 30 mikrolitraan deionisoitua vettä ja sitä säilytettiin 20 °C:ssa. Jäljelle jäänyt morfologinen lahjakortti on talletettu Hokkaidon yliopistomuseoon luettelonumerolla ICHU22080146 (yhteyshenkilö: Dr. Hiroshi Kajihara, [email protected]).
Noin 600 emäsparin fragmentti mitokondriaalisesta sytokromista c oksidaasialayksikön I geeni (COI) monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) käyttämällä LCO1490:tä (5&prime-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3&prime) ja HCO2198:aa (5&prime-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAATCA-3&prime) (Folmer) et ai. 1994). Kuumakäynnistys-PCR suoritettiin lämpösyklilaitteella, iCycler (Bio-Rad), 20 mikronin reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 1 mikrolin templaatin kokonais-DNA:ta (noin 10 &ndash100 ng) ja 19 mikrolin esiseosta, joka oli valmistettu 632 mikrollasta deionisoitua vettä, 80-&mikro Ex Taq Puskuri (TaKara Bio), 64 & mikrolitra dNTP (kukin 25 mM), 8 mikrolitraa kutakin aluketta (kukin 10 & mikroM) ja 0,1 mikrolitraa TaKara Ex Taq (5 U/µl, TaKara Bio). Lämpösykliolosuhteet käsittivät alkudenaturoinnin 95 °C:ssa 30 sekuntia, 30 denaturaatiosykliä 95 °C:ssa 30 sekuntia, hehkutuksen 45 °C:ssa 30 sekuntia ja pidennystä 72 °C:ssa 45 °C:ssa ja lopullisen venymisen 72 °C:ssa.
PCR-tuote puhdistettiin silikamenetelmällä (Boom et ai. 1990). Molemmat juosteet sekvensoitiin BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit -sarjalla (Applied Biosystems) valmistajan ohjetta noudattaen käyttäen samaa alukesarjaa kuin alkuperäisessä PCR-monistuksessa. Sekvensointi suoritettiin ABI Prism 3730 DNA Analyzer -laitteella (Applied Biosystems). Kromatogrammia ja sekvenssitietoja käsiteltiin MEGA v4 -ohjelmistolla (Tamura et ai. 2007).

Tulokset ja keskustelu
Yhteensä saatiin 606 bp COI-sekvenssiä. Kuitenkin tämän sekvenssin nukleotidi-BLAST-haku National Center for Biotechnology Information -keskuksessa osoitti, että sekvenssi oli luultavasti peräisin kalanoidiselta happijalkaisesta, ei askidiasta. Johtopäätöksenä on, että on huolehdittava ruoansulatuskanavan välttämiseksi DNA:n poistamiseksi askidioista.

Taksonomia
Phylum Chordata
Luokka Askidiacea
Perhe Pyuridae Hartmeyer, 1908
Suku Pyura Molina, 1782
Pyura vittata (Stimpson, 1852)
(Kuva 1)



Kuva 1. Pyura vittata (Stimpson, 1852) (ICHU22080146), sivukuva.

Boom, R., Sol., C. J. A., Salimans, M. M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M. E. ja van der Noordaa, J. 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology28: 495&ndash503.

Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R. ja Vrijenhoek, R. 1994. DNA-alukkeet mitokondriaalisen sytokromin amplifikaatioon c oksidaasialayksikkö I erilaisista metazoan selkärangattomista. Molekyylimeribiologia ja biotekniikka 3: 294&ndash299.

Nishikawa, T. 1999. Chordata. Pp. 573&ndash608. Sisään: Nishimura, S. (Toim.) Opas Japanin merenrantaeläimiin värikuvilla ja avaimilla. Voi. II. Hoikusha, Osaka. xii+pls 73&ndash144+663 s.

Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. ja Kumar, S. 2007. MEGA4: Molecullar Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) -ohjelmistoversio 4.0. Molekyylifilogenetiikka ja evoluutio 24: 1596&ndash1599.


Liite
COI-sekvenssi ICHU22080146:sta (tunnistettu ascidiaaniksi Pyura vittata), vaikka luultavasti edustaa calanoid-kärkajalkaista.


Tämä lyhyt toiminta auttaa oppilaita visualisoimaan yhden planeetan tärkeimmistä molekyyleistä, DNA:n. Toiminta voidaan tehdä yksinkertaisilla materiaaleilla, joita löytyy useimmista kodeista. Käytämme banaaneja, mutta myös mansikoita tai muita tarpeeksi pehmeitä hedelmiä voidaan käyttää. Tehtävä on kirjoitettu yläkoulun tai korkeamman tason opiskelijoille, mutta intensiivisemmällä ohjauksella tämä aktiviteetti on hyödyllinen kaiken ikäisille opiskelijoille.

Vaadittu aika: 45 minuuttia

  • Yhden astian saippuaa ja suolaa pitäisi olla enemmän kuin tarpeeksi suuren luokan käyttöön, mutta suosittelemme, että kumpaakin on kaksi käsillä varmuuden vuoksi.
  • Tämä toiminta toimii yleensä paremmin pienten opiskelijaryhmien kanssa, jotka kukin työskentelevät oman banaaninuuton parissa. Tämä tekee myös todennäköiseksi, että ainakin yhdellä ryhmällä on hyvin näkyvä DNA.
  • Varmista, että sinulla on ylimääräisiä vetoketjullisia pusseja ja ylimääräisiä kahvinsuodattimia käsilläsi tauon varalta.
  • Jos kahvinsuodatin hajoaa ja banaanisose putoaa lasin pohjalle, kaada se takaisin pussiin, kiinnitä uusi suodatin ja kaada sose takaisin sisään hitaammin ja anna sen valua kaatamisen aikana.

Laajennukset:

Yhdistettynä Ask A Biologistin lisälukemiseen tai muihin lyhyisiin tehtäviin tämä DNA:n erotustoiminto voi täyttää useita oppimisstandardeja.

  • Tarina "DNA ABCs" auttaa oppilaita ymmärtämään DNA:n merkitystä elämälle sekä DNA:n kemiallista ja fysikaalista rakennetta.
  • Tarinasivu "Getting Genetics Straight" auttaa oppilaita erottamaan geenit ja kromosomit sekä ymmärtämään alleeleja.
  • Lukiolaisille tarina "Controlling Genes" auttaa heitä ymmärtämään proteiinisynteesiä.
  • Opiskelijat voivat yrittää selvittää, kuinka paljon DNA:ta on aikuisen ihmisen kehossa. Voit joko antaa heille seuraavat tiedot tai pyytää heitä etsimään niitä verkosta:

      Solu

      • Tarina "Elämän rakennuspalikoita" auttaa oppilaita ymmärtämään solun rakennetta ja toimintaa.
      • Tarina ”Soluissa elävät solut” auttaa oppilaita ymmärtämään olemassa olevia erilaisia ​​solutyyppejä.
      1. Oppilaat ymmärtävät, että pienet molekyylit ovat konkreettisia.
      2. Opiskelija noudattaa ohjeita ja ymmärtää, että peruskemikaaleja (suoloja ja pesuaineita) voidaan käyttää solujen ja solun osien hajottamiseen ja molekyylien kiinnittymiseen muihin molekyyleihin.
      3. LAAJENNUS: Opiskelija saa perustiedot DNA:n rakenteesta.
      4. LAAJENNUS: Opiskelija ymmärtää solut ja sen, että ne rikkoivat solukalvon ja tumakalvon päästäkseen DNA:han.

      DNA:n erotustekniikka

      Tässä kokeessa tavoitteena on erottaa DNA hedelmänäytteestä. Tätä varten tarvitaan jonkin verran tietoa DNA:n erottamisen taustalla olevasta tieteellisestä taustasta.

      DNA:n uuttoprosessi on melko yksinkertainen biokemiallinen toimenpide, joka voidaan jakaa kolmeen päävaiheeseen: solun avaaminen (lyysi), solun sisällä olevien kalvojen tuhoaminen ja DNA:n saostaminen liuoksesta.

      Seuraavissa osissa kuvataan, miten kukin vaihe liittyy DNA:n fysikaalisiin ja biokemiallisiin ominaisuuksiin.


      • DNA-uuttopuskuri: 1000 ml deionisoitua vettä, 50 ml kirkasta astianpesuainetta, 1 tl suolaa
      • Mansikka (myös muut hedelmät toimivat)
      • Ziploc pussi, kahvinsuodattimet ja suppilot
      • Koeputket, dekantterilasit tai kupit suodoksen keräämiseksi
      • Etanoli tai 91 % isopropyylialkoholi (jäähdytetty)

      1. Lisää mansikka (tai puolikas) Ziploc-säilytyspussiin.
      2. Lisää 10 ml DNA-uuttopuskuria ja muussaa mansikka ja puskuri noin minuutin ajan.
      3. Suodata mansikkamehu dekantterilasiin suppilon ja kahvinsuodattimien avulla.
      4. Siirrä suodos koeputkeen, täytä koeputki vain noin puoliksi ja vältä vaahdon siirtämistä.
      5. Kaada tai tiputa kylmää alkoholia hitaasti mansikkaseoksen päälle. Haluat yhden kerroksen mansikkaseoksen päälle.
      6. Etanolikerrokseen muodostuu valkoisia säikeitä. Käytä sekoitustankoa tai hammastikkua kelataksesi säikeet.


      Johdanto

      Tuhansien kuvattujen lajien kanssa askidiat tai meriruiskut (laji: Chordata, subphylum: Tunicata, luokka: Ascidiacea) muodostavat ainutlaatuisen ryhmän istumattomia meren ei-selkärankaisia ​​sointuja (Shenkar ja Swalla 2011 Shenkar et al. 2012). Koska askidioilla on keskeinen järjestelmällinen asema selkärankaisten sisarryhmänä (Delsuc et al. 2006 Singh et al. 2009), heillä on keskeinen rooli evoluution kehitystutkimuksissa ja niistä on tullut tärkeitä eläinmalleja vertailevassa genomiikassa (Dahlberg ym. 2009). . Ekologisesta näkökulmasta niiden suhteellisen lyhyt elinkaari, niiden kyky menestyä rehevöityneissä (ravintoainerikkaissa) ympäristöissä ja merkittävien petoeläinten puute edistävät niiden menestystä uusissa ympäristöissä (Lambert 2001 Shenkar ja Loya 2008). Seurauksena on, että askidiat ovat meren pahimpien invasiivisten lajien joukossa ja että niiden tulonopeus on lisääntynyt viimeisen vuosikymmenen aikana (Lambert 2009). Siksi on välttämätöntä kehittää työkaluja, joiden avulla voimme erottaa ei-alkuperäiset lajit alkuperäisistä ja selvittää tuotujen lajien alkuperäpopulaatiot. Valitettavasti askidian systematiikka on tunnetusti vaikeaa, koska lajit luokitellaan enimmäkseen sisäisten anatomisten ominaisuuksien, kuten sukurauhasten tai suolen silmukan muodon ja sijainnin sekä haarapussirakenteiden perusteella (Monniot et al. 1991). Tästä johtuen ascidian lajien väärintunnistukset ovat yleisiä (Mastrototaro ja Dappiano 2008 Lambert 2009). Molekyylisekvenssit tarjoavat tavan täydentää lajien tunnistamista erityisesti tilanteissa, joissa perinteinen morfologiaan perustuva taksonien erottelu ei ole riittävää (Geller et al. 2010). Molekyylimarkkerit ja erityisesti mitokondrioiden (mt) DNA-sekvenssit tarjoavat siten tehokkaan vaihtoehdon morfologiselle lähestymistavalle. Esimerkkinä mainittakoon, että mt-DNA:ta on käytetty menestyksekkäästi osoittamaan yksiselitteisesti kahden salaperäisen lajin olemassaolo kosmopoliittisessa askidiassa. Ciona intestinalis (Iannelli, Pesole, et al. 2007). Siitä huolimatta askidiat ovat nopeasti kehittyviä lajeja (Yokobori et al. 1999, 2005 Tsagkogeorga, Turon, et al. 2010), ominaisuus, joka vaikeuttaa niiden molekyyliominaisuuksien käyttöä niiden evoluutiohistorian päättelemiseksi (Delsuc et al. 2006). Tarkemmin sanottuna askidian mt-genomit ovat hypervariaabelia lähes kaikissa genomipiirteissä, joita ovat esimerkiksi erittäin korkeat sekvenssien erot ja rehottavat geenijärjestyksen uudelleenjärjestelyt, jopa matalilla taksonomisilla tasoilla, kuten sukulaisissa ja kryptisissä lajeissa (Iannelli, Griggio et al. 2007 Gissi et al. 2010). Tämä ascidian mt-genomien erittäin nopea evoluutio tekee niiden sekvenssien monistamisesta haastavan tehtävän, mikä puolestaan ​​selittää näiden sekvensoitujen genomien niukkuuden. Pyrimme siis kehittämään yksinkertaisen ja tehokkaan menetelmän, jolla täydelliset ascidian mt-genomit voidaan hankkia helposti.

      Seuraavan sukupolven sekvensointitekniikat (NGS) ovat mullistaneet tiedonkeruun biologiassa. Vaikka sekvensointiprotokollat ​​kehitettiin alun perin genomin tai transkription erottamiseksi yhdestä organismista, on mahdollista sekoittaa useita näytteitä yhdessä virtaussolussa (eli multipleksisekvensointi), kunhan sekvenssit eri näytteistä voidaan myöhemmin erottaa. Vakiomultipleksimenetelmät mahdollistavat jopa 96 eri näytteen yhdistämisen lisäämällä viivakoodeja (tai tunnisteita) DNA-kirjaston valmistuksen aikana (Binladen et al. 2007). Sekvensointivaiheen jälkeen luennot erotetaan niiden viivakooditunnisteiden perusteella siten, että kokoonpano suoritetaan jokaiselle näytteelle erikseen. Tämän lähestymistavan etuna on mahdollisuus luoda kompromissi yhdestä NGS-ajosta saatavilla olevien lukujen kokonaismäärän ja kunkin yksittäisen näytteen halutun kattavuuden saavuttamiseksi tarvittavan lukumäärän välillä. Tällaisen lähestymistavan haittana on kuitenkin se, että jokaiselle näytteelle on rakennettava erilliset genomikirjastot, mikä voi olla kallista. Useat tutkimukset ovat ehdottaneet useiden näytteiden sekoittamista ilman viivakoodausta ja sekvenssien erottamista vasta kokoamisvaiheen jälkeen (Pollock ym. 2000 McComish et al. 2010 Timmermans et al. 2010 Dettai et al. 2012). Viittaan tässä vain ei-teoreettisiin tutkimuksiin. Julkaisussa Timmermans et ai. (2010), kokoonpanon jälkeinen erottelu perustui syöttisekvensseihin, jotka ovat lyhyitä sekvenssejä (200𠄱 000 bp), jotka saatiin jokaisesta näytteestä Sanger-sekvensoinnilla. Julkaisussa McComish et ai. (2010), erottelu suoritettiin vertaamalla koottuja jatkumoja läheisesti toisiinsa liittyvien referenssi-mt-genomien joukkoon. Sekä Timmermans et ai. (2010) ja McComish et ai. (2010) sekvensoi pitkän polymeraasiketjureaktion (PCR) monistetut fragmentit, jotka kattavat koko mitogenomin. Valitettavasti pitkien PCR-fragmenttien hankkiminen on äärimmäisen vaikeaa vaippaeläimissä läpitunkeutuvien geenijärjestyksen uudelleenjärjestelyjen vuoksi. Lisäksi PCR-artefaktit voivat joskus aiheuttaa kimeerisiä mt-kontigeja (Timmermans et al. 2010).

      Tässä työssä päätimme käyttää Illumina-alustaa sekvensoimaan useiden lajien genomiuutteita, jotka on sekoitettu keskenään. Siten useiden lajien sekä tuma- että mt-DNA-fragmentit sekvensoitiin yhdessä, ja mtDNA-sekvenssit haettiin laskennallisesti kokoamisvaiheen kautta. Lähestymistapamme on samanlainen kuin Groenenberg et al. (2012), joka sai etanan täydellisen mitogenomin Illumina-sekvensoinnilla ja yhdestä museonäytteestä uutetun kokonais-DNA:n de novo -kokoonpanolla. Seuraamalla Timmermansin et ai. (2010), syöttisekvenssejä käytettiin tässä tunnistamaan kunkin näytteen mt-sekvenssit läheisesti sukua olevien sekvenssien sijaan, kuten McComish et al. (2010), koska sekvensoimme esimerkiksi ensimmäisen edustajan suvusta, jonka fylogeneettisesta asemasta keskustellaan (esim. Corellidae Tsagkogeorga et al. 2009). 𠇋rute force”-lähestymistapamme etuna on, että se ei riipu tietyistä alukkeista tai rikastusprotokollasta ja se on sokea mt-geenijärjestykseen. Tätä lähestymistapaa käyttämällä kokosimme onnistuneesti viisi uutta täydellistä mitogenomia: Rhodosoma turcicum (Phlebobranchia: Corellidae), Botrylloides aff. leachii ja Polycarpa mytiligera (Stolidobranchia: Styelidae), Halocynthia spinosa, ja Pyura gangelion (Stolidobranchia: Pyuridae) ( kuva 1 A ja CFvastaavasti). Lisäksi, käyttämällä tavallisia PCR- ja Sanger-sekvensointimenetelmiä, saimme mt-genomin Ascidiella aspersa (Phlebobranchia: Ascidiidae) (kuva 1 B). Kuvaamme ja käsittelemme uutta lähestymistapaamme mtDNA-sekvensointiin NGS-teknologiaa käyttäen sekä näiden kuuden uuden ascidian mt-genomin ominaisuuksia genomin organisoinnin ja fylogeneettisen signaalin suhteen.

      Tässä työssä sekvensoidut askidialaiset lajit. (A) Rhodosoma turcicum (Corellidae), (B) Ascidiella aspersa (Ascidiidae), (C) Botrylloides aff. leachii (Styelidae), (D) Polycarpa mytiligera (Styelidae), (E) Halocynthia spinosa (Pyuridae) ja (F) Pyura gangelion (Pyuridae).


      DNA:n puhdistus ja väkevöinti vesiliuoksista

      Tämä yksikkö esittelee perusmenettelyt yksi- tai kaksijuosteisen DNA:n liuosten käsittelyyn puhdistus- ja konsentrointivaiheiden kautta. Nämä tekniikat ovat hyödyllisiä, kun proteiineja tai liuenneita molekyylejä on poistettava vesiliuoksista tai kun DNA-liuokset on väkevöitävä. The

      , jossa käytetään fenoliuuttoa ja etanoli- (tai isopropanoli) saostusta, on sopiva DNA:n puhdistamiseen pienistä tilavuuksista (<0,4 ml) pitoisuuksilla, jotka ovat alle 1 mg/ml. Kolme tukiprotokollaa hahmottelee menetelmiä uuttoissa käytetyn fenolin puskuroimiseksi, DNA:n konsentroimiseksi butanolia käyttäen ja orgaanisten jäännösliuottimien uuttamiseksi eetterillä. Vaihtoehtona näille menetelmille on nukleiinihappopuhdistus lasihelmiä käyttäen ja tämä on myös esitetty. Näitä protokollia voidaan käyttää myös RNA:n puhdistamiseen. Kahta viimeistä vaihtoehtoista protokollaa käytetään RNA:n konsentroimiseen ja DNA:n uuttamiseen ja saostamiseen suuremmista tilavuuksista ja laimeista liuoksista sekä pienimolekyylipainoisten oligonukleotidien ja trifosfaattien poistamiseen.


      DNA:n erottaminen kasvien lehdistä mikroneulalappulla

      Korkealaatuisen DNA:n eristäminen infektoituneista kasvinäytteistä on olennainen vaihe kasvipatogeenien molekyylien havaitsemisessa. DNA:n eristäminen kasvisoluista, joita ympäröivät jäykät polysakkaridisoluseinät, sisältää kuitenkin monimutkaisia ​​vaiheita ja vaatii työpöytälaboratoriolaitteita. Tämän seurauksena kasvien DNA:n uuttaminen rajoittuu tällä hetkellä hyvin varustettuihin laboratorioihin, ja näytteiden valmistelusta on tullut yksi suurimmista esteistä kasvipatogeenien paikan päällä tapahtuvalle molekyylien havaitsemiselle. Tämän esteen voittamiseksi on kehitetty yksinkertainen DNA-uuttomenetelmä kasvien lehtikudoksista. Polyvinyylialkoholista (PVA) valmistettu mikroneula (MN) -laastari voi eristää kasvi- tai patogeenisen DNA:n eri kasvilajeista minuutissa. DNA-uuton aikana polymeerinen MN-laastari tunkeutuu kasvin lehtikudoksiin ja rikkoo jäykät kasvien soluseinät eristääkseen solunsisäisen DNA:n. Uutettu DNA on polymeraasiketjureaktiolla (PCR) monistettavissa ilman lisäpuhdistusta. Tämä minimaalisesti invasiivinen menetelmä on onnistuneesti uutettu Phytophthora infestans DNA tartunnan saaneista tomaatin lehdistä. Lisäksi MN-laastaria voitaisiin käyttää DNA:n eristämiseen muista kasvipatogeeneista suoraan pellolla. Siten sillä on suuri potentiaali tulla nopeaksi paikan päällä käytettäväksi näytteenvalmistustekniikaksi kasvien patogeenien havaitsemiseen. © 2020, John Wiley & Sons, Inc.

      Perusprotokolla: Mikroneulalappupohjainen DNA-uutto

      Tukiprotokolla 1: Mikroneulalappujen valmistus

      Tukiprotokolla 2: Mikroneulalla uutetun DNA:n reaaliaikainen PCR-monistus


      Viitteet

      Sinha R, Abu-Ali G, Vogtmann E, Fodor AA, Ren B, Amir A, Schwager E, Crabtree J, Ma S, Abnet CC, et ai. Microbiome Quality Control (MBQC) -projektikonsortion mikrobiyhteisön amplikonin sekvensoinnin vaihteluarviointi. Nat Biotechnol. 201735:1077–86.

      Costea PI, Zeller G, Sunagawa S, Pelletier E, Alberti A, Levenez F, Tramontano M, Driessen M, Hercog R, Jung FE, et ai. Kohti ihmisen ulostenäytteen käsittelyn standardeja metagenomisissa tutkimuksissa. Nat Biotechnol. 201735:1069–76.

      Human Microbiome Project Consortium. Terveen ihmisen mikrobiomin rakenne, toiminta ja monimuotoisuus. Luonto. 2012486:207–14.

      Qin J, Li R, Raes J, Arumugam M, Burgdorf KS, Manichanh C, Nielsen T, Pons N, Levenez F, Yamada T, et ai. Ihmisen suoliston mikrobigeeniluettelo, joka on perustettu metagenomisella sekvensoinnilla. Luonto. 2010464:59–65.

      Marotz C, Amir A, Humphrey G, Gaffney J, Gogul G, Knight R. DNA-uutto eri ympäristönäytteiden virtaviivaistettua metagenomiikkaa varten. Biotekniikat. 201762:290–3.

      Wesolowska-Andersen A, Bahl MI, Carvalho V, Kristiansen K, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Licht TR. Bakteerien DNA-uuttomenetelmän valinta ulostemateriaalista vaikuttaa yhteisön rakenteeseen metagenomisella analyysillä arvioituna. Mikrobiomi. 20142:19.

      Franzosa EA, Morgan XC, Segata N, Waldron L, Reyes J, Earl AM, Giannoukos G, Boylan MR, Ciulla D, Gevers D, et ai. Ihmisen suolen metatranskription ja metagenomin yhdistäminen. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014111:E2329–38.

      Horz HP, Scheer S, Huenger F, Vianna ME, Conrads G. Bakteeri-DNA:n selektiivinen eristäminen ihmisen kliinisistä näytteistä. J Microbiol Methods. 200872:98–102.

      Marotz CA, Sanders JG, Zuniga C, Zaramela LS, Knight R, Zengler K. Syljen haulikon metagenomiikan parantaminen kemiallisen isäntä-DNA:n ehtymisen avulla. Mikrobiomi. 20186:42.

      Eisenhofer R, Minich JJ, Marotz C, Cooper A, Knight R, Weyrich LS. Kontaminaatio matalamikrobibiomassan mikrobiomitutkimuksissa: kysymyksiä ja suosituksia. Trends Microbiol. 201927:105–17.

      Salter SJ, Cox MJ, Turek EM, Calus ST, Cookson WO, Moffatt MF, Turner P, Parkhill J, Loman NJ, Walker AW. Reagenssi- ja laboratoriokontaminaatio voi vaikuttaa kriittisesti sekvenssipohjaisiin mikrobiomianalyyseihin. BMC Biol. 201412:87.

      Glassing A, Dowd SE, Galandiuk S, Davis B, Chiodini RJ. Uutto- ja sekvensointireagenssien luontainen bakteeri-DNA-kontaminaatio voi vaikuttaa mikrobiotan tulkintaan pienissä bakteeribiomassanäytteissä. Suoliston sairaus. 20168:24.

      Minich JJ, Zhu Q, Janssen S, Hendrickson R, Amir A, Vetter R, Hyde J, Doty MM, Stillwell K, Benardini J et ai. KatharoSeq mahdollistaa korkean suorituskyvyn mikrobiomianalyysin vähäbiomassaisista näytteistä. mSystems. 20183.

      Morales E, Chen J, Greathouse KL. Ihmisen mikrobiomin koostumusanalyysi syöpätutkimuksessa. Menetelmät Mol Biol. 19282019:299–335.

      Dejea CM, Wick EC, Hechenbleikner EM, White JR, Mark Welch JL, Rossetti BJ, Peterson SN, Snesrud EC, Borisy GG, Lazarev M, et ai. Mikrobiootan järjestäytyminen on proksimaalisten paksusuolensyöpien erityinen piirre. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014111:18321–6.

      Bullman S, Pedamallu CS, Sicinska E, Clancy TE, Zhang X, Cai D, Neuberg D, Huang K, Guevara F, Nelson T, et ai. Fusobakteerin pysyvyyden ja antibioottivasteen analyysi kolorektaalisyövässä. Tiede. 2017358:1443–8.

      Huseyin CE, Rubio RC, O'Sullivan O, Cotter PD, Scanlan PD. Sieniraja: vertaileva analyysi ihmisen suoliston mykobiomin tutkimuksessa käytetyistä menetelmistä. Edessä Microbiol. 20178:1432.

      Rosenbaum J, Usyk M, Chen Z, Zolnik CP, Jones HE, Waldron L, Dowd JB, Thorpe LE, Burk RD. Suuontelo-DNA-uuttomenetelmien arviointi bakteeri- ja sienimikrobista. Sci Rep. 20199:1531.

      Shkoporov AN, Ryan FJ, Draper LA, Forde A, Stockdale SR, Daly KM, McDonnell SA, Nolan JA, Sutton TDS, Dalmasso M, et ai. Toistettavat protokollat ​​ihmisen ulosteen fageomien metagenomiseen analyysiin. Mikrobiomi. 20186:68.

      Kim D, Hofstaedter CE, Zhao C, Mattei L, Tanes C, Clarke E, Lauder A, Sherrill-Mix S, Chehoud C, Kelsen J et ai. Menetelmien optimointi ja sudenkuoppien välttäminen mikrobiomitutkimuksessa. Mikrobiomi. 20175:52.

      Hornung BVH, Zwittink RD, Kuijper EJ. Mikrobiomitutkimuksen valvontaan liittyvät ongelmat ja nykyiset standardit. FEMS Microbiol Ecol. 201995. https://doi.org/10.1093/femsec/fiz045

      Sinha R, Ahsan H, Blaser M, Caporaso JG, Carmical JR, Chan AT, Fodor A, Gail MH, Harris CC, Helzlsouer K, et al: Seuraavat vaiheet ihmisen mikrobiomin ja terveyden tutkimisessa tulevaisuuden tutkimuksissa, Bethesda, MD, 16.-17.5.2017. Mikrobiomi 2018, 6:210.

      Sinha R, Abnet CC, White O, Knight R, Huttenhower C. Mikrobiomin laadunvalvontaprojekti: perustutkimuksen suunnittelu ja tulevaisuuden suunnat. Genome Biol. 201516:276.


      Biology Lab -raportti klorofyllin uuttamisesta

      Tiivistelmä Tämä koe keskittyi kloroplastin pigmenttien uuttamiseen ja erottamiseen. Toimenpidettä varten vihreät lehdet jauhettiin huhmareessa joidenkin kemikaalien kanssa ja neste suodatettiin käytettäväksi lisäanalyysiä varten. Tämän liuoksen raidat laitettiin suodatinpaperille ja myöhemmin kuivauksen jälkeen ne asetettiin liuotinmajakkaan. Tämän jälkeen kloroplastipigmentit erotettiin liuottimella enemmän tai vähemmän liukenevien pigmenttien ryhmiksi.

      Tavoite Kuinka monta pigmenttityyppiä vihreässä lehdessä on? Sen toivotaan pystyvän tunnistamaan lehden neljä erilaista pigmenttityyppiä.

      Koska liuotinta sisältävä suodatinpaperi erottaa pigmentit liukoisuuden suhteen, kunkin pigmentin selkeän segmentoitumisen odotetaan näkyvän. Koska tämän laboratorion koko prosessissa käytettiin erilaisia ​​kemikaaleja, tietyt muuttujat ovat saattaneet vaikuttaa tuloksiin kunkin kemikaalin tai käytetyn suodoksen puhtauteen.

      Tausta Kloroplasti on pohjimmiltaan fotosynteesistä vastaava organelli.

      Rakenteellisesti se on hyvin samanlainen kuin mitokondrio. Se sisältää läpäisevän ulkokalvon, vähemmän läpäisevän sisäkalvon, välitilan ja sisäosan, jota kutsutaan myrskyiksi. Kloroplasti on kuitenkin suurempi kuin mitokondrio. Sen on oltava suurempi koko, koska sen kalvoa ei ole taitettu Cristaliin. Myöskään sisäkalvoa ei käytetä elektronien kuljetusketjuun.

      Itse asiassa ensimmäinen käyttämämme suodos ei sisältänyt edes tarpeeksi pigmenttejä, jotka reagoivat liuottimeen saadakseen hyödyllisiä tuloksia. Suodoksen ja paperiliuskan menetelmien uusimisen jälkeen liuotin alkoi tehdä tehtäväänsä. Noin 10 minuutissa liuotin oli hitaasti imeytynyt paperiin harmaaseen kynäviivaan asti. Sitten nauhan kuivaamisen jälkeen pystyi tuskin tunnistamaan kahta erillistä väriä, joista kumpikin oli vain muutaman millimetrin päässä: sinivihreä ja kellertävänvihreä viiva.

      Sitten opettaja Glen antoi meille asteikon, jolla meidän pitäisi tunnistaa jokainen pigmenttiliuska sen yksilöllisen värin mukaan, mitata sen etäisyys alkuperään (ensimmäinen suodoksella piirretty viiva) ja laskea sitten REF. Ensin piti tunnistaa jokaisen tarkka väri, mikä oli hieman ongelmallista eri sävyjen kirjosta johtuen. Kuten kuvassa 1 tai tietotaulukossa 2 on esitetty, kunkin värinauhan jakautumiselle on asetettu järjestys. REF laskettiin seuraavalla kaavalla: REF = Pigmentin siirtymä etäisyys (mm)

      Etäisyys liuotinrintamalla kulkeutunut (mm) Kuva 1 – Karoteeni (oranssi) – Karoteeni – Psykoanalyytikkopigmentit kloroplastissa – Klorofylli – Klorofylli A (sinivihreä) – Klorofylli B (Klorofylli) Kuten odotettiin, liuotin on aiheuttanut pigmenttien siirtymisen liukoisuusryhmiinsä. Kellertävänvihreä klorofylli B oli ensimmäinen tunnistamamme vyöhyke, joka siirtyi vain mm ja sinivihreä klorofylli A mm. Tämä kertoi meille, että vihreällä lehdellä oli vain klorofylliä, vaikka myös muut tämän kokeen suorittaneet opiskelijat saavuttivat erilaisia ​​tuloksia.

      Ainoa ongelma, joka voidaan mainita laboratorion kokonaissuunnittelusta, on huoneiden ilmanvaihtojärjestelmä. Liuottimen pullon avaamisen jälkeen koko huoneeseen tuli vain parissa minuutissa erittäin voimakas haju, joka sai muutaman opiskelijan huimausta tai päänsärkyä. Tähän ongelmaan ei ole varsinaisia ​​ehdotuksia, paitsi puhuminen koulun huoltohenkilöstön kanssa ja käskeä heitä korjaamaan tuulettimet. Syitä outoihin tuloksiin saattoi johtaa vain siitä, että ehkä tässä kokeessa käytetyt kemikaalit eivät olleet tarpeeksi puhtaita, samoin kuin itse tehty suodos.


      Katso video: Pyura. Estadio Luna Park TEASER (Joulukuu 2022).